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科研實(shí)驗中要使ELISA試劑盒測定得到準確的結果，不論是定性的還是定量的，必須嚴格按照規定的方法制備試劑和實(shí)施測定。一般性試劑，如包被緩沖液、洗滌液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反應終止液等，配制時(shí)不可掉以輕心。
(一)加樣
在ELISA試劑盒中除了包被外，一般需進(jìn)行45加樣。在定性測定中有時(shí)不強調加樣量的準確性，例如規定為加樣一滴。此時(shí)應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規定配制。加樣時(shí)應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現氣泡。
(二)保溫
在ELISA試劑盒中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結合物后，此時(shí)反應的溫度和時(shí)間應按規定的要求，保溫容器zui好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要。加入底物后，反應的時(shí)間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實(shí)驗臺上，以便不時(shí)觀(guān)察，待對照管顯色適當時(shí)，即可終止酶反應
(三)洗滌
洗滌在ELISA試劑盒過(guò)程中不是反應聚，但卻是決定實(shí)驗成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)以及在反應過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA試劑盒測定的反應過(guò)程中應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時(shí)又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯一類(lèi)物質(zhì)即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據脂肪酸的種類(lèi)而對聚山梨酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中zui為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。
洗滌如不*，特別在zui后一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體作用而產(chǎn)生干擾。
ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內反應液;②將洗滌液注滿(mǎn)板孔;③放置2min，略作搖動(dòng);④吸干孔內液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數一般為3～4次，有時(shí)甚至需洗5～6次。
(四)比色
如陰性對照顏色極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定結果，準確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計的質(zhì)量。
