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支原體污染細胞后,有必要清除支原體,常用方法有:
1、對于非重要的細胞,如培養中的細胞、WCB的細胞等,將培養物與用過(guò)的培養基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細胞,如來(lái)源珍貴或實(shí)驗室中細胞保藏量較小等可以采用以下(2)-(8)的方法。
2、用MRA處理:用支原體清除劑(Mycoplasma Removal Agent)處理細胞,作用濃度為 25μg/ml,兩周可以清除支原體。
3、用清洗純化法清除支原體污染的方法:細胞營(yíng)養馴化→優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌,其原理是利用離心力、細胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過(guò)反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至ji 限. 如結合敏感抗生素的抑殺作用,可達到更好的效果。
4、藥物輔助加溫處理:先用藥物處理后,再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時(shí),可殺死支原體,但對細胞有不良影響。
5、使用支原體特異性血清:用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長(cháng),故經(jīng)抗血清處理后11天即轉為陰性,并且5個(gè)月后仍為陰性。
6、動(dòng)物體內接種除菌法:把受支原體污染的腫瘤細胞接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔中,借動(dòng)物免疫系統消滅支原體,而腫瘤細胞卻能在體內繼續生長(cháng),待一定時(shí)間后,從體內取出細胞再進(jìn)行培養繁殖。
7、巨噬細胞吞噬法:從動(dòng)物腹腔采取巨噬細胞,為排除其它細胞成分,可先進(jìn)行純化,然后再加入被支原體污染的細胞培養液中混合培養。在培養過(guò)程中,為檢查支原體是否已被消除干凈,可利用支持物培養法驗證,取出支持物逐日染色、鏡檢觀(guān)察,至支原體已被消除干凈為止。
8、使用支原體清除培養基,每2~3天更換1次新鮮培養液,換液時(shí)用無(wú)菌的平衡鹽溶液洗滌細胞1~2次;期間如果細胞密度過(guò)大,請保持細胞密度適當(貼壁細胞可能需要用胰酶消化),并更換新的培養器皿,3天之后,即可見(jiàn)明顯清除效果;處理15天后,可以用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測,檢測支原體是否殺滅*;如果仍有支原體殘留,可以考慮再處理6天;為避免細胞再次受到“支原體"的污染,以后每隔1個(gè)月進(jìn)行支原體的常規檢測,以保證沒(méi)有新的支原體污染。
注:支原體污染時(shí)細胞表現為長(cháng)得不好,也不死亡,同時(shí),培養基又是清亮的,時(shí)間長(cháng)達一周也沒(méi)有什么變化,這時(shí)基本上可以判斷出是支原體污染了。