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逆轉錄（reverse transcription）實(shí)驗作為是常見(jiàn)的分子生物學(xué)實(shí)驗之一，逆轉錄是以 RNA 為模板合成 DNA 的過(guò)程，即 RNA 指導下的 DNA 合成，逆轉錄實(shí)驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板。雖然看上去步驟簡(jiǎn)單，但是逆轉錄實(shí)驗中實(shí)際操作時(shí)常出現問(wèn)題如下：
1. 如何提高 RT-PCR 反應的靈敏度與特異性？
① 確定模板 RNA 完整性好，無(wú) DNA 污染。
② RNA 模板中不應含有擴增反應抑制劑。
③ 使用適量的模板 RNA ，模板量太多會(huì )降低特異性，太少會(huì )導致擴增不出條帶或條帶太弱。
④ 若模板中有二級結構，可通過(guò)提高逆轉錄反應溫度來(lái)提高擴增效果。
2. RNA 中含有逆轉錄抑制劑時(shí)，怎么處理？
逆轉錄抑制劑包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等?？蓪⒁汛_定的高質(zhì)量 RNA 模板同樣品混合，同高質(zhì)量 RNA 模板比較產(chǎn)量以檢測 RNA 抑制劑；若高質(zhì)量模板 RNA 與樣品混合后產(chǎn)量降低，則說(shuō)明樣品中存在逆轉錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對 RNA 沉淀進(jìn)行清洗，以除去抑制劑。
3. 逆轉錄后的 qPCR 實(shí)驗 Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。
① RNA 模板質(zhì)量差，需要重新制備 RNA 模板，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。
② 逆轉錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉錄試劑成分，可能會(huì )對后續的PCR 產(chǎn)生抑制作用，所以可以適當梯度提高 cDNA 稀釋比例（通常來(lái)說(shuō)可將 cDNA 原液稀釋5-10倍，其*佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好）。
③ 起始的 RNA 模板量低，需要減少稀釋倍數或增加 RNA 模板量。
④ 基因本身原因（復雜和長(cháng)度），可以重新設計復雜基因的引物，避免復雜結構?；蛘哂萌椒ǔ绦蚧蜓娱L(cháng)兩步法程序的延伸時(shí)間。
⑤ 逆轉錄或者定量產(chǎn)品性能差，可以通過(guò)做平行不用品牌產(chǎn)品對比實(shí)驗，對比逆轉錄產(chǎn)品性能。
4. 逆轉錄酶擴增效率評估，應該關(guān)注哪些指標？
建議： qPCR-ct 值，或者 PCR 產(chǎn)量
如果想比較逆轉錄性能，尤為直接的還是后續做 qPCR 或者 PCR 平行對比實(shí)驗，這種方法相對較為準確。
不建議：cDNA 中間產(chǎn)物濃度測定 or 其他方法。
逆轉錄完成后是不建議測定產(chǎn)物濃度的，由于逆轉錄后產(chǎn)生 RNA-cDNA 雜交鏈，溶液中的 RNA 和部分 DNA 會(huì )對吸光值產(chǎn)生影響，所以測定出來(lái)的產(chǎn)物濃度并不準確，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進(jìn)行對比實(shí)驗，由于不同品牌之間的逆轉錄體系具有或多或少的差異，其體系中的各種離子等都能對吸光度產(chǎn)生影響，所以測定的結果也沒(méi)有可比性。
優(yōu)化及注意事項：
1、 逆轉錄 PCR 時(shí)，提取 RNA 是關(guān)鍵，需分離高質(zhì)量 RNA（純度和完整性）。
2、 整個(gè)操作過(guò)程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。
3、 逆轉錄過(guò)程中要謹防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制劑。
4、 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。
5、 逆轉錄實(shí)驗應全程在冰上操作完成，操作過(guò)程應避免 RNase 污染。
6、 提高逆轉錄預熱溫度（也可根據相應逆轉錄試劑盒進(jìn)行調整）。
7 減少基因組 DNA 污染，可使用去基因組的逆轉錄試劑盒。
