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ELISA即酶聯(lián)吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法。ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，下面盤(pán)點(diǎn)ELISA測定操作技術(shù)要求如下：
1、嚴格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2、檢測前應將試劑放置室溫平衡半小時(shí)，洗滌液應現用現配，同時(shí)觀(guān)察濃縮洗滌液中有無(wú)結晶，若有結晶應放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB時(shí)應注意有無(wú)顏色變化，若已顯色則可能過(guò)期或變質(zhì)，也不可使用。
3、加樣后及時(shí)放入孵育箱。標本較多時(shí)，要分批操作。按照說(shuō)明書(shū)步驟嚴格控制操作時(shí)間，防止孵育時(shí)間人為延長(cháng)，導致非特異性結合緊附于反應孔周?chē)?，難以清洗*。
4、封板溫育時(shí)，各孔一定要封嚴，防止陽(yáng)性標本的液體蒸發(fā)，不會(huì )引起孔間的污染，產(chǎn)生周邊現象從而導致“花板“的出現。
5、應保證酶標版清潔，整個(gè)操作過(guò)程中保證酶標版不接觸次氯酸。
6、加酶試劑后用吸水紙在酶標版表面輕拭吸干。
7、合理安排檢測量，以免反應板過(guò)多造成洗板等待時(shí)間長(cháng)。
8、手動(dòng)洗板時(shí)，加洗液要快速，沒(méi)有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無(wú)粉塵和碎屑的吸水紙。需要用力拍板，使孔內沒(méi)有可見(jiàn)液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標板拍干后立即做后續的加液。
9、用洗板機洗板時(shí)，保證洗液注滿(mǎn)各孔，洗板針暢通，洗完版后在吸水紙（選擇干凈，無(wú)塵的吸水材料）上輕輕拍干。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結晶，將堵塞洗板機針孔，造成全堵或半堵?tīng)顟B(tài)，以致使未結合的酶標記物不能*洗脫，而使最后底物顯色時(shí)加深，造成假陽(yáng)性或花板。廢液瓶裝滿(mǎn)后應及時(shí)清空，以防止廢液回流對管道的污染，而使洗滌不*，造成花板。洗板結束后應用蒸餾水*清洗管道，以防止廢液在管道中的殘留。洗滌次數及加液量不可*按照試劑說(shuō)明書(shū)設定，應根據本實(shí)驗室的實(shí)際情況來(lái)設定，開(kāi)展新項目前，應做好驗證工作，根據洗滌的效果來(lái)決定洗滌的次數和加液量。同時(shí)應根據儀器維護保養程序，定期對洗板機進(jìn)行維護保養。
10、加樣量的準確與否，直接影響抗原抗體結合物的濃度，直至最后顯色的深淺。吸嘴插入血清不可太深，若插入太深，吸嘴外壁可能粘連太多血清，輕微的抖動(dòng)動(dòng)即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中，造成交叉污染。加樣時(shí)應盡可能的垂直加樣，并加在包被孔的底部，不可加在孔的上部。標本量大時(shí)，可考慮使用排槍加試劑，可提高速度，但使用排槍時(shí)應注意吸嘴一定要裝好，不可松動(dòng)，否則會(huì )影響加樣量的準確度。加樣時(shí)保持顯色劑不外流，顯色劑應避免接觸金屬器械。加終止液時(shí)應避免產(chǎn)生氣泡。
11、加樣時(shí)間間隔對結果也有一定的影響，在競爭抑制法試驗中，理論上應該是標本與酶標抗體混合后同時(shí)加入反應孔，若標本先于酶標抗體加入反應孔，則標本會(huì )先與包被抗體進(jìn)行反應，造成特異性假陽(yáng)性。若是有干擾物質(zhì)存在時(shí)表現明顯，在公平條件下，干擾物質(zhì)與包被抗體的結合能力會(huì )低于標本，而在非公平條件下，干擾物質(zhì)會(huì )優(yōu)先與包被抗體進(jìn)行結合，出現假陽(yáng)性。做HBcAb項目時(shí)，若標本與酶加樣時(shí)間間隔太長(cháng)，會(huì )引起吸光度的趨勢性變化，會(huì )造成吸光度的降低。特別是針對臨界值標本，出現假陽(yáng)性。
12、洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。洗液需要稀釋時(shí)，應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質(zhì)量的超純水或雙蒸水，電導率小于1.5μS/cm,洗液如果結晶應待其溶解后配制。配制后要測定其pH值，使其范圍在7.2-7.4之間。
