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逆轉錄（reverse transcription），是以RNA為模板合成DNA的過(guò)程，合成的DNA稱(chēng)為cDNA。逆轉錄過(guò)程遺傳信息的流動(dòng)方向為RNA到DNA，與轉錄過(guò)程DNA到RNA的方向相反，故稱(chēng)為逆轉錄。
一、實(shí)驗原理要素：
酶促催化使RNA反轉錄為cDNA第一鏈。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與RNA雜交，然后由RNA依賴(lài)的DNA聚合酶催化合成相應互補的cDNA拷貝，后者能進(jìn)一步用于PCR擴增。依據實(shí)驗的不同目的，針對cDNA第一鏈合成的引物可根據特殊的靶基因設計，或可用隨機引物與所有mRNA雜交。
實(shí)驗要素：
逆轉錄實(shí)驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：
逆轉錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個(gè) T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對，可合成全長(cháng)的 cDNA，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ，對模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實(shí)驗。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基，可隨機識別模板并結合，適合復雜結構和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續 qPCR 實(shí)驗?；蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列，具有特異性強，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列。所以根據不同實(shí)驗需求可進(jìn)行相應引物的選擇。
2. 逆轉錄酶：
一種是來(lái)自純化的禽成髓細胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長(cháng)度。另一種來(lái)源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的 RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長(cháng) cDNA 有很大好處。
3. RNA 模板：
通常利用紫外分光光度計檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì )產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA 條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無(wú) gDNA 和蛋白殘留。
二、實(shí)驗流程：
1. 實(shí)驗前準備
RNA樣品、逆轉錄試劑盒（以諾唯贊R312為例）
2. 實(shí)驗步驟
① 試劑化凍后，用手輕彈混勻后短暫離心。
② 基因組DNA（gDNA）去除：根據RNA樣品的濃度按10pg~1μg計算用量，在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA樣品，總體系為10μL。用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀，設置反應條件為42℃ 2min。
③ 第一鏈cDNA合成：根據上一步反應管的數量按以下體系在RNase-free離心管中配制預混液：RNase-free ddH2O 5μL，逆轉錄引物（2μM）1μL，10×RT Mix 2μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，用移液器吹打混勻后短暫離心。在上一步得到的反應管中每管加入10μL，用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀，設置反應條件為25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min。所得cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應或-20℃保存。
三、注意事項：
1. 防止RNase污染：保持實(shí)驗區域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩；實(shí)驗所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。
2. 反應液的配制要在冰上操作完成，防止溫度過(guò)高造成RNA降解。
3. cDNA保存時(shí)避免反復凍融。
四、常見(jiàn)問(wèn)題：
1. 逆轉錄后的產(chǎn)物可以測濃度嗎？
不建議測濃度，一般評估RNA模板的質(zhì)量，需要從濃度、純度及完整性三方面進(jìn)行考量，但逆轉錄后的產(chǎn)物是一個(gè)混合體系，有cDNA、未全逆轉錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分，會(huì )干擾cDNA的吸光度，因此不建議用逆轉錄后的cDNA來(lái)檢測濃度與純度。
2. 如何檢測RNA逆轉錄成功與否？
1) 內參法：理論上，逆轉錄的cDNA是長(cháng)度不同的DNA片段，所以電泳條帶應該均勻分布在泳道上，如果RNA豐度低，電泳檢測也可能無(wú)產(chǎn)物，這種情況通過(guò)PCR擴增內參基因，如果有擴增產(chǎn)物，cDNA的質(zhì)量基本上可以保證(少數情況下：如目的基因片段過(guò)長(cháng)，可能會(huì )有例外)。
2) 已知基因擴增法：如果有已知以此模板擴出來(lái)的基因，可以用此基因的引物驗證。能擴增出內參，不一定就說(shuō)明cDNA沒(méi)有問(wèn)題，因為內參在cDNA中豐度高，容易擴增。如果cDNA因為各種原因導致部分降解，則會(huì )大大影響低豐度的目的基因的PCR結果，而內參因為是高豐度基因，擴增很可能不受影響。
3. 逆轉錄產(chǎn)物中存在gDNA對后續qPCR實(shí)驗有何影響？
當cDNA產(chǎn)物中混有gDNA時(shí)，cDNA和gDNA在qPCR反應時(shí)會(huì )被同時(shí)擴增，無(wú)法區分熒光信號是來(lái)自于cDNA還是gDNA，因此定量結果可能會(huì )存在偏差。特別是低表達量的基因，本身的擴增信號低，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影響。在逆轉錄的時(shí)候，加一步gDNA去除的步驟，能夠有效降低gDNA污染的影響，增加實(shí)驗的可信度。
