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ELISA又稱(chēng)酶聯(lián)免疫吸附測定，是定量檢測體液中各種靶標蛋白含量的常用方法。其呈色反應可進(jìn)行定性或定量分析，利用HRP酶催化TMB，反應產(chǎn)生藍色亞胺溶液，加入終止液后，使藍色陽(yáng)離子轉變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌。除了常見(jiàn)的藍色和黃色，ELISA實(shí)驗過(guò)程中，也會(huì )出現一些不同尋常的多樣色彩。
一、墨綠色 / 深藍色
例：加入底物溶液孵育后，酶標板孔溶液變成墨綠色或深藍色。
在正常的ELISA實(shí)驗中，加入底物溶液孵育后，標曲前四孔出現明顯藍色梯度，即可終止反應。但是，當孵育的HRP酶結合物工作液濃度過(guò)高，或樣本濃度遠高于檢測范圍時(shí)，標曲最高1-2個(gè)梯度孔或樣本孔可能會(huì )呈現墨綠色或深藍色。
墨綠色樣本終止反應后，在450nm波長(cháng)下讀取的OD值可能會(huì )比實(shí)際要低；深藍色標曲會(huì )由于梯度OD值過(guò)于接近，無(wú)法擬合得到有效標曲并準確計算樣本濃度。
建議：
（1）嚴格控制每一步的孵育溫度和時(shí)間，按照說(shuō)明書(shū)要求制備HRP酶結合物工作液；
（2）在顯色階段，通過(guò)前四孔出現明顯藍色梯度來(lái)控制顯色時(shí)間；
（3）濃度過(guò)高的樣本需要稀釋到試劑盒檢測范圍內，再進(jìn)行測定。
二、黃色
例：終止反應后，整板變成黃色。
可能原因：
1 競爭法按照夾心法操作：兩者原理不同，操作步驟不同，請注意區分。
2 洗滌不當：甩板時(shí)離廢液桶太近，導致液體反濺；甩板不干脆，導致液體殘留或流入其他孔；洗滌時(shí)每孔注入的洗液不夠，或洗滌次數不夠；液體過(guò)多溢出污染；浸泡時(shí)間過(guò)短；
3 顯色劑保存不當，或孵育時(shí)未避光，造成非特異性顯色；
4 孵育溫度過(guò)高，或孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)；
5 不同試劑盒組分混用或替代，產(chǎn)生基質(zhì)效應或非特異性吸附，導致假陽(yáng)性結果。
三、標曲正常，樣本孔全黃
讀值計算后，發(fā)現標曲擬合效果良好，但樣本OD超過(guò)標曲最大OD，表明樣本還需要稀釋哦。
四、 黑色
例：加入終止液后，酶標板孔中液體變黑，或產(chǎn)生黑色沉淀。
可能原因：
1、HRP酶濃度過(guò)高：準備HRP酶工作液時(shí)，保證計算和配制體積準確，按照說(shuō)明書(shū)中的洗滌體積、時(shí)間、次數進(jìn)行洗板；
2、樣本中指標濃度過(guò)高，樣本還需要稀釋?zhuān)?/p>
3、終止液中硫酸濃度過(guò)高或變質(zhì)：終止液是1M H2SO4，混用過(guò)高濃度的硫酸可能導致炭化反應。
