公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

與Bst 2.0 DNA 聚合酶和Bst DNA 聚合酶大片段相比，Bst 3.0 DNA聚合酶具有更佳的等溫擴增活性和更強的逆轉錄活性。無(wú)論以DNA還是RNA為模板，該酶都具有5’-3’的DNA聚合酶活性和強烈的鏈置換活性，但該酶5’-3’和3’-5’的外切酶活性缺失。
在以RNA為模板的LAMP實(shí)驗中，可實(shí)現單酶系統反應。
該酶在60-65°C之間具有很好的反轉錄活性，可有效解決具有二級復雜結構的RNA模板的反轉錄，而B(niǎo)st 2.0 DNA 聚合酶和Bst DNA 聚合酶大片段無(wú)此活性。

單位定義：
一個(gè)活力單位即在 65°C 條件下，30 分鐘內催化 10 nmoldNTP 的摻入反應成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量。
儲存：-20℃ 可保存 3 年。
典型的 LAMP 反應
1. 按以下組分配制 LAMP 反應液
Bst 3.0 DNA/RNA Polymerase (8 U/μl) 0.25~1 μl
10×Isothermo Buffer(Mg2+ free) 2.5 μl
100 mM Mg2+X μl
dNTP Mixture (10 mM each) 3.5 μl
模板 DNA/RNA 10ng~1 μg
*10X Primers 2.5 μl
ddH2O Up to 25 μl
*10X Primers：16 μM FIP/BIP, 2 μM F3/B3, 4-8 μM LpF/B each。
2. 65°C 30~60min; 85°C 5min 失活。
使用注意事項：
(1) Mg2+的使用濃度為 4~10 mM 濃度，Isothermo Buffer中沒(méi)有 Mg2+，通常情況下，在 6-8mM Mg2+條件下可獲得較好的 LAMP 結果。
(2) 有文獻報道加入 Tte Uvrd 解旋酶可改善 LAMP 的效果。
(3) 使用無(wú)模板 DNA 作為對照檢測擴增的特異性。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實(shí)驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產(chǎn)物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時(shí)不同溫度環(huán)節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進(jìn)行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關(guān)基礎實(shí)驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(cháng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱(chēng)接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結合上的引物開(kāi)始沿著(zhù)DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴(lài)于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴(lài)于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(cháng)度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈是保證整個(gè)PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續時(shí)間過(guò)長(cháng)，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時(shí)間:

PCR擴增特異性取決于復性過(guò)程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時(shí)間，可根據待擴增片段的長(cháng)度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(cháng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過(guò)長(cháng)可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數:

其他參數選定后，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多，非特異擴增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：